Микроскоп. Методы и техника микроскопии

КЛЕТОК ПРОКАРИОТ И ЭУКАРИОТ

Цели занятия:

· Изучить устройство светового микроскопа, освоить методику установки света, технику приготовления и микроскопирования временных препаратов.

· Познакомиться со строением клетки, научиться отличать прокариотические клетки от эукариотических.

· Научиться правильно оформлять отчет о лабораторной работе.

Вопросы и задания для самоподготовки

1. Биология как наука. Методы биологии.
2. Основные концепции биологии.
3. Основные свойства живых систем.
4. Уровни организации живой материи.
5. Современное определение жизни и живого организма.

6. Основные положения современной клеточной теории.

7. Надцарства (империи) и царства живых организмов.

8. Строение прокариотической клетки.

9. Уметь показать на микроскопе механическую, оптическую и осветительную части и рассказать об их устройстве.

10. Какие бывают окуляры; объективы и их фокусное расстояние. Особенности иммерсионного объектива.

11. Что такое увеличение и разрешающая способность микроскопа?

12. Настройка освещения по методу светлого поля.

13. Основные правила работы с оптическим микроскопом.

14. Постоянные и временные микропрепараты. Основные этапы приготовления временных микропрепаратов.

Оборудование и материалы :

1. Микроскоп Микмед -5 или аналог.

2. Предметные и покровные стекла, чашки Петри, стаканчики с водой, глазные пипетки, пинцеты, ножницы, кусочки ваты, иммерсионное масло.

3. Постоянные микропрепараты: фиксированные окрашенные мазки культур сенной палочки и сарцины, крови лягушки.

4. Материалы для приготовления временных препаратов: 2-3 головки репчатого лука.

5. 0,01% раствор метиленовой сини, раствор иода.

РАБОТА 1.1. Изучение устройства светового микроскопа

Световая микроскопия – один из основных методов изучения биологических объектов, поэтому владение техникой микроскопирования необходимо для всех последующих занятий по биологическим наукам, а также для практической деятельности микробиолога.

Рассмотрим конструкцию световых микроскопов на примере микроскопа отечественного производства Микмед - 5. Световой микроскоп состоит из трех основных частей: механической, осветительной, оптической. К механической ч а с т и относятся: штатив, револьверное устройство, макро- и микрометрические винты, предметный столик (рис.1).

Рисунок 1 – Устройство светового микроскопа Микмед -5

1 – окуляры; 2 – бинокулярная насадка; 3 – винт крепления насадки; 4 – револьверное устройство; 5 – объективы; 6 – штатив; 7 – предметный столик; 8 – кольцо;
9 – рукоятка механизма грубой фокусировки (кремальера); 10 – рукоятка механизма микрометрической фокусировки; 11 – выключатель; 12 – рукоятка регулирования яркости источника света; 13 – винт крепления конденсора; 14 – конденсор; 15 – основание штатива; 16 – препаратоводитель; 17 – рукоятка перемещения объекта в продольном направлении; 18 – рукоятка перемещения объекта в поперечном направлении; 19 – коллектор в корпусе

Штатив состоит из массивного основания и изогнутого под углом тубусодержателя. Основание имеет снизу четыре опорные площадки, что обеспечивает устойчивое положение микроскопа на рабочем столе.

В верхней части тубусодержателя имеется головка для закрепления бинокулярной насадки и гнездо с винтовой нарезкой для револьвера. Тубус (окулярная трубка) представляет собой полую трубку, в верхнюю часть которой вставляется окуляр.

Револьвер (от лат. revolvo – вращаю) – это вращающийся диск с четырьмя гнездами для ввинчивания объективов.

Винт грубой фокусировки микроскопа – макрометрический винт , или кремальера – расположен с левой стороны штатива. С помощью этого винта предметный столик передвигается в вертикальном направлении вверх и вниз на большое расстояние. Макрометрический винт используется при слабом увеличении, когда объект изучается главным образом в одной плоскости.

Рукоятки микрометрической фокусировки (они - меньшего диаметра)расположены с обеих сторон штатива,используются при сильном увеличении и позволяют при их использовании рассматривать детали объекта, лежащие на разной глубине. Ими следует пользоваться только тогда, когда при помощи кремальеры объект поставлен точно в фокус.

Предметный столик представляет собой четырехугольную пластину с отверстием в центре, над которым помещают предметное стекло с изучаемым объектом. Во избежание смещения, предметное стекло фиксируют специальным прижимом препаратоводителя. Справа под предметным столиком находятся рукоятки механизма координатного перемещения, с помощью которого препарат можно передвигать в поперечном и продольном направлениях.
Осв е т и т е л ь н а я ч а с т ь микроскопа состоит из осветителя, конденсора с ирисовой диафрагмой и съемного светофильтра.
Осветитель встроен в основание штатива. Он включается с помощью выключателя, расположенного на боковой поверхности штатива справа от наблюдателя. Яркость источника света можно изменить, вращая рукоятку регулирования яркости источника света (расположена на штативе справа, под выключателем).
Держатель патрона галогенной лампы прикреплен к основанию штатива двумя винтами снизу, доступ к которым обеспечивается при наклоне прибора. Винты в отжатом состоянии позволяют перемещать держатель патрона с лампой в бобовидных отверстиях основания в случае неравномерного освещения объекта. Если в данном микроскопе источником света является светодиод, то его перемещение при настройке освещения не требуется.

Конденсор находится под предметным столиком, состоит из двух линз, закрепленных в общую оправу, вставлен в кронштейн, который крепится к предметному столику. Для перемещения конденсора служит специальная рукоятка, расположенная слева от наблюдателя. Меняя положение конденсора, можно изменять интенсивность освещения объекта: при опускании освещенность уменьшается, при поднимании – увеличивается.

Ирисовая диафрагма вмонтирована в нижнюю часть конденсора. Она представляет собой кольцо с подвижно укрепленными стальными пластинками, которые могут сдвигаться и раздвигаться с помощью особой ручки; в центре остается отверстие для прохождения светового пучка. Диафрагма позволяет регулировать величину светового потока; максимально суженная, она способствует наибольшей четкости изображения.

О п т и ч е с к а я ч а с т ь микроскопа представлена окулярами и объективами.

Окуляр (от лат. oculus – глаз) помещается в верхней части тубуса и обращен к глазу. Окуляр представляет собой две линзы, заключенные в металлическую гильзу. По числу на верхней плоскости окуляра можно судить о кратности его увеличения (х7, х10, х15). Окуляр можно вынимать из тубуса и заменять по мере необходимости другим.

Объектив – это система линз, укрепленных в общей металлической оправе. Объективы ввинчиваются в гнезда револьвера и имеют различную кратность увеличения, которая обозначена числом на их боковой поверхности. Различают объективы малого увеличения (х4 и х10), объектив большого увеличения (х40) и иммерсионный объектив (х100), используемый для изучения наиболее мелких объектов.

Все объективы по способу применения делят на сухие и иммерсионные (от лат. immersio – погружаю или окунаю). У сухих объективов между фронтальной линзой и рассматриваемым препаратом находится воздух. Воздух и стекло имеют разные показатели преломления света (соответственно 1,0 и 1,52), в результате чего лучи света, переходя из одной среды в другую, преломляются, рассеиваются, происходит частичное искажение рассматриваемых объектов (рис.2). У иммерсионных объективов пространство между фронтальной линзой и препаратом заполнено, как правило, кедровым маслом или водой. Предметное стекло, стекло объектива и кедровое масло имеют почти одинаковый показатель преломления света (1,52 и 1,515), поэтому лучи, проходя из одной среды в другую, почти не преломляются, свет не рассеивается, рассматриваемые объекты не искажаются. Показатель преломления света, близкий к таковому стекла, имеют и другие вещества, которые используются в качестве иммерсионных составов: касторовое масло (1,48-1,49), гвоздичное масло (1,53), смесь касторового и гвоздичного масел (1,515).

Рисунок 2 – Ход лучей между конденсором и объективом микроскопа

Справа – сухой объектив, слева – иммерсионный. 1 – линза объектива; 2 – верхняя линза конденсора; 3 – предметное стекло; 4 – объект; 5 – покровное стекло; 6 – иммерсионное масло; 7 – воздух. АБ – луч света, проходящий через воздушную среду, отклоняется и не попадает в объектив; ВГ – луч света, проходящий через иммерсионное масло, попадает в объектив.

Общее увеличение микроскопа равно произведению увеличения объектива на увеличение окуляра. Эта величина, однако, не характеризует всех возможностей микроскопа. Увеличенное изображение может быть как четким, так и нечетким. Отчетливость получаемого изображения определяется разрешающей способностью микроскопа. Под последней понимают минимальное расстояние между двумя видимыми точками, когда они еще не сливаются в одну, т.е. чем лучше разрешающая способность, тем меньший объект можно увидеть.

Разрешающая способность светового микроскопа определяется в основном дифракцией световых лучей и равна примерно половине длины волны используемого света. Освещая препарат светом с более короткой длиной волны (голубым или синим), можно увидеть более мелкие объекты; при этом разрешающая способность микроскопа близка к 0,2 мкм. С этой целью микроскоп укомплектован синим светофильтром.

ЗАДАНИЕ . Ознакомьтесь с устройством световых микроскопов. Найдите и назовите все их основные части.

РАБОТА 1.2. Приготовление временного препарата.

Настройка освещения

Наилучшие результаты при работе с микроскопом могут быть получены лишь при условии правильного освещения объекта. Вот один из способов установки света на микроскопе Микмед - 5.

1. Для настройки микроскопа приготовьте препарат, который представляет собой два положенных крест-накрест волоса. Для приготовления этого временного препарата отрежьте ножницами часть волоса длиной примерно 3 см, разрежьте его пополам и поместите оба кусочка друг на друга на предметное стекло, сделав перекрест. Затем глазной пипеткой нанесите на волосы каплю воды и накройте покровным стеклом.

Постарайтесь избежать образования пузырьков воздуха под покровным стеклом: возьмите покровное стекло за боковые грани и прикоснитесь его ребром к поверхности капли воды с краю так, чтобы вода растеклась по ребру покровного стекла, затем осторожно опустите (уроните) покровное стекло на предметное. Научитесь брать каплю жидкости такого объема, чтобы она заполнила все пространство под покровным стеклом. Слишком малая капля жидкости не заполнит всего пространства, и оставшийся в виде пузырьков воздух затруднит работу. Взяв слишком большую каплю, вы увидите, что вода выступила за пределы покровного стекла. В этом случае избыток воды нужно удалить полоской фильтровальной бумаги.

Препарат поместите на предметный столик и закрепите его прижимом препаратоводителя. Поставьте место перекреста волос точно в центр светового пучка. Вместо указанного препарата может быть использован любой другой препарат, детали которого хорошо различимы при малом увеличении.

2. Установите в рабочее положение объектив малого увеличения (х4). Когда объектив займет срединное положение над отверстием столика, в револьвере сработает защелка, при этом будет слышен легкий щелчок, и револьвер фиксируется. Поднимите конденсор до упора. При переходе к объективам других увеличений положение конденсора по высоте не менять.

3. Смотря сбоку, с помощью макрометрического винта поднимите предметный столик почти до соприкосновения объекта с с фронтальной линзой объектива. Глядя в окуляр, медленным вращением кремальеры в обратном направлении осторожно опускайте предметный столик до тех пор, пока в поле зрения не появятся очертания объекта. С помощью рукоятки механизма микрометрической фокусировки добейтесь резкого изображения объекта.
4. Выньте окуляр из правой окулярной трубки бинокулярной насадки. Наблюдая в окулярную трубку, раскройте апертурную диафрагму конденсора до размера выходного зрачка объектива.
5. Установите окуляр в окулярную трубку, наблюдайте поле зрения окуляра. При неравномерно освещенном поле зрения отцентрируйте лампу, как указано в руководстве по эксплуатации. Для достижения наилучшего качества изображения рекомендуется для каждого объектива прикрывать апертурную диафрагму конденсора на 1/3 выходного зрачка объектива, а также использовать синий светофильтр.
Нормальная работа осветительной системы обеспечивается только при использовании предметных стекол толщиной 1 – 2 мм.

ЗАДАНИЕ . Приготовьте микропрепарат и настройте освещение, как указано выше.

Последняя четверть XIX столетия ознаменовалась углублением исследований строения тканей и клеток, что сделалось возможным вследствие успехов, достигнутых в усовершенствовании микроскопа и особенно в разработке тех приемов микроскопического исследования, какими мы пользуемся и в настоящее время.

Высокие и неуклюжие, на наш взгляд, микроскопы первой половины XIX в. во второй его половине принимают более практичные формы. Укорачивается тубус, устанавливается стандартная высота предметного столика. Штатив становится более массивным и устойчивым, ножка его, которой ранее придавалась круглая форма или вид треножника, теперь устраивается чаще всего в виде подковы, что дает лучшую устойчивость. Отверстие предметного столика снабжается диафрагмами в виде сменяющихся цилиндров или круга с отверстиями разного диаметра, вращающегося под предметным столиком. Все микроскопы снабжаются микрометрическим винтом, а большие штативы, кроме того, кремальерой.

Окуляры начинают изготовлять более светосильными, причем обращается внимание на выпрямление поля зрения. Особенные улучшения были достигнуты в конструкции объективов. Уже в первой половине XIX в. некоторые фирмы изготовляли объективы, дававшие с сильными окулярами увеличение более чем в 1000 раз. Но практическое применение таких сильных систем было ограничено тем, что поле зрения становилось темным, так как при малом фокусном расстоянии значительное количество лучей, преломляясь в воздухе, отклонялось и не попадало в объектив. Коренное улучшение было достигнуто введением иммерсионных объективов.

Принцип иммерсии, т. е. погружения объектива в жидкую среду, помещенную между объектом и фронтальной линзой, предложил в 1850 г. Дж. Амичи. Вначале он употреблял для иммерсии растительное масло, но отличия в показателе преломления заставили заменить масло водой. Хотя вода также отличалась по показателю преломления от стекла, все же водная иммерсия была известным достижением и для некоторых специальных целей употребляется и в наше время.

Во второй половине прошлого века появилось большое число оптических фирм, изготовлявших микроскопы. Кроме уже ранее получившей известность фирмы Шевалье, продолжает работу оптический институт Оберхейсера; из Франции он был переведен в Германию и в Потсдаме продолжал деятельность под фирмой Гартнака (Hartnack). В 1859 г. эта фирма внесла в конструкцию иммерсионных объективов некоторые улучшения, и в 60-х и 70-х годах микроскопы Гартнака считались одними из лучших. Продолжала деятельность фирма Шик в Берлине. Бывший институт Фраунгофера под фирмой Мерц (G. und С. Merz) изготовлял большие штативы с многими объективами и механическими приспособлениями. В 1849 г было организовано производство микроскопов в Ветцларе (Германия), позже получившее широкую известность под фирмой Лейтца (Ernst Leitz).

Прогресс в конструкции микроскопов во второй половине XIX в. неразрывно связан с немецкой оптической фирмой Цейсса, обязанной своими успехами выдающемуся физику Аббе.

В 1846 г. оптик Карл Цейсс (Cazl Zeiss, 1816-1888) основывает в Иене мастерскую, которую талант и выдающиеся способности Аббе превратили в оптический институт мирового значения. Личность Аббе представляет, помимо его научных заслуг, большой интерес. Сын ткацкого мастера в Эйзенахе, в детстве видевший нужду в семье, Эрнст Аббе (Ernst Abbe, 1840- 1905) уже мальчиком обнаружил исключительные способности, обратившие на него внимание учителей, настоявших на его дальнейшем образовании. По окончании университета Аббе занимает кафедру теоретической физики в Иене (1870), а позже становится директором Иенской обсерватории (1877-1890). По предложению Цейсса, состоявшего университетским механиком, Аббе принимает участие в работах организованных Цейссом оптических мастерских, становится совладельцем, а до смерти Цейсса владельцем фирмы. Однако Аббе отказался от прав владельца предприятия и, сохранив за собой руководство, передал доходы от предприятия в пользу рабочих и служащих Аббе разрабатывает математически теорию микроскопа, доведя до предела оптические возможности светового микроскопа. По его инициативе и под его руководством при заводе организован научный оптический институт, где разрабатывается система измерений, дающих научный критерий для оценки качеств микроскопа. Создаются новые сорта стекла (по инициативе Аббе создано известное производство «иенского стекла» Шотта); производство микроскопов становится на подлинно научное основание. Н. А. Умов (1846-1915), выдающийся русский физик, в проникновенной статье, посвященной памяти Аббе, писал: «Аббе заменил работу ощупью и наугад точным теоретическим вычислением наиболее выгодных форм оптических стекол, их кривизны и взаимных расстояний в связи с физическими свойствами стекол, из которых они должны быть изготовлены. Через несколько лет упорного труда микроскопы Цейсса, построенные по указаниям Аббе, превзошли по своим качествам все до того времени известные» (Н. А. Умов, 1905).

Первым крупным достижением оптического института Цейсса явилось изготовление масляного иммерсионного объектива, так называемой гомогенной иммерсии, основанной на применении кедрового масла. Этот объектив был рассчитан на применение в качестве иммерсионной среды кедрового масла и имел неоспоримое преимущество перед водной иммерсией Амичи. Масляный иммерсионный объектив был изготовлен впервые в 1878 г. по указанию Стефенсона (Stephenson) в Лондоне и под руководством Аббе. Это было крупнейшим достижением в технике микроскопии. Исследователь получил сильный объектив, который давал возможность применять большие увеличения, не ослабляя освещенности поля зрения. Масляная гомогенная иммерсия быстро завоевала признание и обусловила успехи цитологии в последней четверти прошлого века.

Применение масляной иммерсии требовало реконструкции системы освещения объекта. Еще в 1873 г. Аббе конструирует особый осветительный аппарат, позволяющий использовать все достоинства нового объектива. Этот «осветительный аппарат по Аббе» становится обязательной частью всякого исследовательского микроскопа.

По вычислениям Аббе фирма Цейсс выпустила в 1886 г. новые объективы-апохроматы, где коррекция сферической и хроматической аберрации доведена до предела. В комбинации с особыми компенсационными окулярами апохроматы явились последним словом оптической техники светового микроскопа. Как показали исследования Аббе, изготовлением апохроматов с высокой апертурой достигнут предел разрешающей способности линз микроскопа, поставленный длиной светового луча (в нашем веке этот предел возможностей микроскопического исследования преодолен изобретением электронного микроскопа). Аббе сконструировал также рисовальный аппарат, позволяющий производить точную зарисовку микроскопических объектов.

Достижения Аббе были использованы другими фирмами, получившими известность во вторую половину прошлого столетия. В Ветцларе в 1873 г. открыла производство фирма Зейберт (Seibert); ее микроскопы славились в конце прошлого столетия. Около 1872 г. в Гёттингене открывается оптический институт Винкеля (Winkel), изготовлявший превосходные инструменты и выпустивший флюоритные системы, более дешевые, чем апохроматы, но сохраняющие ряд свойственных им преимуществ. Нет надобности упоминать множество других оптических производств этого периода. Отметим только сыгравшую значительную роль в распространении микроскопа французскую фирму Нашэ (Nachet), микроскопы которой имели в прошлом веке значительное распространение, и австрийскую фирму Рейхерт (С. Reichert) в Вене, основанную в 1876 г., микроскопы которой при хорошем качестве подкупали относительной дешевизной. Несколько своеобразно развивалось производство микроскопов в Англии, где долгое время были распространены громоздкие штативы на треножниках, мало похожие на установившуюся на континенте форму микроскопа.

Обращено было внимание также и на конструкцию штатива микроскопа. Во второй половине прошлого столетия существенную лепту в этом отношении вложил А. И. Бабухин (1835-1891), крупный русский гистолог, основатель московской гистологической школы и одной из первых микробиологических лабораторий, в ходу был даже термин «бабухинский штатив». Прямая колонка микроскопов, характерная для конца прошлого столетия, в нашем столетии приобрела форму изогнутой ручки. Особенно резкие изменения приобрел штатив в последние десятилетия: тубус принял изогнутую форму, винты перенесены под предметный столик; в ряде моделей микроскоп монтируется вместе с лампой, микрофотографическим аппаратом и т. д.

Выдвинутое Брюкке предположение о сложности строения «элементарного организма» - клетки носило априорный характер; фактических данных для такого предположения тогда еще не было. Чтобы клетка в понимании биолога перестала быть простым комочком протоплазмы, нужны были более совершенные методы исследования, чем те способы микроскопического изучения тканей, какие применялись в первой половине прошлого столетия. Но постановка проблемы есть путь к ее решению. Потребность проникновения в тонкое строение клетки побуждала к поискам новых методов микроскопического исследования. Вся последняя четверть прошлого века проходит под знаком усовершенствования микроскопической техники, причем это касается как микроскопа и ряда вспомогательных приборов, так и методики подготовки объектов для изучения.

История микроскопической техники остается пока ненаписанной главой науки. В литературе встречаются лишь случайные и порой неточные справки, касающиеся отдельных деталей. Поэтому написание этой главы книги представило значительные трудности, и она содержит многочисленные пробелы.

Микроскоп, как бы он ни был усовершенствован, не дал бы возможности проникнуть в тонкие гистологические структуры, если бы параллельно с совершенствованием микроскопа не развивалась техника обработки материала, техника изготовления «микроскопического препарата». Микроскописты первой половины XIX в. изучали ткани либо в свежем состоянии, либо в состоянии начального посмертного изменения. Методы подготовки материала ограничивались расщипыванием или раздавливанием тканей и применением таких реактивов, как уксусная кислота, щелочи, йод и редко спирт. Постоянных препаратов в тот период не изготовляли, и это, конечно, очень затрудняло исследование.

Уже во второй четверти прошлого столетия начинаются поиски консервирующих жидкостей, в которых ткани можно было бы сохранить на препарате в течение продолжительного времени. Главным ингредиентом в таких жидкостях была сулема, применявшаяся в большом разведении. В 1839 г. Гудбай (Goodbay) предложил «универсальную консервирующую жидкость» для изготовления постоянных препаратов, содержавшую сулему, поваренную соль и квасцы. Поэтому образцу ряд других микроскопистов пытались создать варианты консервирующих сред для заключения объекта. Но консервирующее действие таких сред было плохим, и их нельзя ставить на один уровень с современными фиксаторами. Положительное их значение заключалось в том, что они выявили преимущество изучения тканей не в воздухе, а в жидкой среде, и поэтому, начиная с сороковых годов, делаются попытки найти удобные среды для заключения объекта. С другой стороны, эти жидкости имели и отрицательное значение. В то время как раньше изучались преимущественно свежие объекты, появление консервирующих жидкостей повело к тому, что исследователь, подвергнув ткань расщипыванию или раздавливанию, заключал ее в консервирующую среду и полагал, что он изготовил «постоянный препарат». В действительности же в этой жидкости ткани подвергались таким изменениям, что строение не сохранялось, и изучались искаженные остатки структуры.

Только в шестидесятых годах начали применяться более рациональные методы заключения объекта в жидкие среды. Удовлетворительным методом явилось заключение в глицерин, которое начали впервые применять в Англии. Наряду с глицерином применялись различные смеси: глицерин с желатиной, глицерин с гуммиарабиком. Эти среды давали несомненное преимущество перед водой и в шестидесятых годах имели широкое применение.

Канадский бальзам (обычная среда для заключения объекта в современной микротехнике) пробовали применять давно. Еще в 1832 г. его пытался использовать Бон (Bond), а в 1835 г, - Причард (J. С. Pritchard, 1786-1848). Но первые попытки применения канадского бальзама давали плохие результаты, так как объекты предварительно подвергались просушиванию. Впервые в 1851 г. английский невролог Кларк (Jacob A. L. Clarke, 1817-1880), изготовляя препараты мозга, попытался обойти высушивание и использовал обезвоживание препарата спиртом, а затем просветление его в скипидаре. Тем не менее еще в 1868 г. английский микроскопист Бил (L. S. В. Beal, 1828- 1906) в руководстве микротехники указывает, что при применении канадского бальзама объект должен быть высушен при высокой температуре. Метод Кларка также не давал хороших результатов, так как обезвоживание было недостаточным. В 1865 г. немецкий патологоанатом Риндфлейш (Rindfleisch, 1836-1908) предложил применять гвоздичное масло, а в 1863 г. русский гистолог К. З. Кучин (1834-1895), а позже дерптский анатом Л. X. Штида (1837-1918) применили креозот. Штида также ввел в употребление бергамотное масло. При плохом обезвоживании эти средства давали вначале недостаточные результаты (лучше других был креозот, допускающий меньшее обезвоживание). Только в семидесятых годах, когда научились производить достаточное обезвоживание объекта, канадский бальзам получает преимущество перед другими средами и находит широкое применение.

Однако основным недостатком старой техники изготовления постоянных препаратов было отсутствие фиксации. Методы фиксации возникли на основе методики уплотнения тканей. Для изготовления срезов из мягких тканей исследователи искали средства их уплотнения. Одним из первых уплотняющие жидкости начал применять Пуркине. В 40-50-х годах уплотнение тканей для изготовления разрезов становится общепринятым.

В 1840 г. датский анатом и патолог Ганновер (Adolph Н. Hannover, 1814-1894) помещает в «Мюллеровском архиве» статью о «хромовой кислоте, превосходном средстве для микроскопических исследований», и с этого времени хромовая кислота является одним из употребительнейших реактивов для уплотнения, а в дальнейшем - и фиксации животных тканей. Позже для этой цели начинает применяться двухромокислый калий. В поисках лучших средств для сохранения структуры тканей микроскописты пытаются составлять сложные фиксаторы, в состав которых входят различные ингредиенты. Г. Мюллер (Н. Muller, 1820-1864), профессор анатомии в Вюрцбурге, известный своими исследованиями по анатомии глаза, предложил в 1859 г. уплотняющую жидкость, из комбинации двухромокислого калия и сернокислого натрия, знаменитую «мюллеровскую жидкость», в течение многих лет являвшуюся распространенным гистологическим фиксатором. В конце 60-х годов французский гистолог Ранвье (Louis A. Ranvier, 1835-1922) предложил для уплотнения и фиксации пикриновую кислоту, которая нашла в дальнейшем широкое признание.

Значительный прогресс в фиксации тканей был достигнут применением для этой цели сулемы. В консервирующих жидкостях она употреблялась давно, но там ее концентрация была недостаточна для фиксации тканей. В качестве фиксатора сулема вошла в гистологическую технику лишь после 1878 г., когда швейцарский зоолог Ланг (Arnold Lang, 1855-1914) предложил применять ее в концентрированных растворах и в комбинации с уксусной кислотой. Для фиксации тонких гистологических структур сулему впервые употребил выдающийся немецкий физиолог Рудольф Гейденгайн (Rudolf Heidenhain, 1834-1897) в 1888 г. Ингредиенты для составления фиксаторов обогатились далее введением в гистологическую технику осмиевой кислоты (Макс Шульце, 1864), сохраняющей особенно хорошо липоидные структуры клетки. Применение осмиевой кислоты в качестве фиксатора в комбинации с другими реактивами широко вошло в обиход гистологической техники. Флеш (Max Flesch) в 1879 г. предложил комбинацию хромовой и осмиевой кислот, а в 1882 г. Флемминг, один из крупнейших гистологов конца прошлого века (с его именем мы встретимся дальше), предложил свою известную фиксирующую жидкость. Вплоть до 70-х годов микроскописты говорили не о фиксации, а о консервировании и уплотнении тканей. Термин «фиксация» и связанное с ним понятие входит в употребление только в начале 80-х годов. В состав флемминговской жидкости входили хромовая, осмиевая и уксусная кислоты; она долгое время считалась лучшим фиксатором для изучения тонкого строения клеток. Современные фиксирующие жидкости Шампи и Мевеса представляют собой ее модификацию. В 1894 г. К. Ценкер (К. Zenker) предложил свое видоизменение мюллеровской жидкости, добавив к ней сулему и уксусную кислоту. Эта ценкеровская жидкость и теперь остается одним из лучших и употребительнейших фиксаторов. В 1893 г. Блум (F. Blum) вводит в употребление формалин, получивший в дальнейшем широкое применение как фиксатор.

Таким образом, к 80-м годам гистология обогащается значительным арсеналом фиксаторов, сохраняющих структуру тканей; отходит на задний план изучение тканей в свежем состоянии; с каждым годом пополняется список реактивов, применяемых для фиксации гистологических объектов; множатся бесчисленные предложения о составе фиксирующих жидкостей и смесей, из которых только небольшое количество прочно вошло в микроскопическую практику.

В этом развитии микроскопической техники нельзя не отметить отрицательного момента. Во-первых, успехи методов фиксации привели к тому, что исследование свежего материала было заброшено; структуры фиксированной протоплазмы некритически воспринимались как прижизненные структуры, и на этой почве было немало увлечений и сделано немало ошибок. Сама методика фиксации развивалась эмпирически: исследователи, пробуя тот или другой фиксатор, часто не исходили из научных оснований, а бессистемно отыскивали практически пригодные реактивы.

Так как уже с XVIII в. начали применять для микроскопии проходящий свет, возникает необходимость соответствующей обработки объекта. Исследователи первой половины XIX в. пытались обойти эту трудность изучением тонких пленок или кусочков ткани, подвергнутых расщипыванию иглами или раздавливанию. Это грубо нарушало структуру тканей. По отношению к более плотным тканям для получения тонких прозрачных пластинок давно начали применять бритву. Мягкие ткани для приготовления из них срезов с помощью бритвы зажимали в мякоть ветки бузины или в уплотненную долгим пребыванием в хромовой кислоте печень. В середине прошлого столетия для изготовления срезов стали применять заливку в более плотные среды. В пятидесятых годах ботаник Фенцль (Eduard Fenzl) предложил для этой цели парафин в 1856 г. Бёттхер (А. В. Bottcher, 1831-1889), профессор в Дерпте, начал применять желатину. Вначале при заливании в парафин не получалось пропитывания объекта, и, естественно, такая заливка не давала хороших результатов. В конце 70-х годов начинают применять промежуточные среды: гвоздичное масло, креозот, бергамотное масло, ксилол; но только с введением заливки в термостатах (W. Giesbrecht, 1881) применение парафина дало хорошие результаты и вошло в постоянный обиход микроскопической техники. В 1879 г. французский гистолог Дюваль (Mathias Duval, 1844-1907) предложил новую среду для заливания объектов - коллодий. Немецкий гистолог Шиффердеккер (Paul Schiefferdecker, 1849-1931) заменил коллодий целлоидином, занявшим, наряду с парафином, прочное место в качестве среды для заливки объектов с целью получения тонких срезов.

Так как приготовление тонких срезов ручной бритвой требовало большого искусства и все же толщина их была слишком велика, возникает мысль о конструкции специального прибора для получения тонких срезов - микротома. Одна из первых попыток такого рода - «резательная машина» была по конструкции Каммингса описана Дж. Гиллом. Было и еще несколько аналогичных не удержавшихся конструкций Г Современный микротом ведет свое начало от микротома Ошатца (ученика Пуркине), сконструированного в 1844 г. Усовершенствованный немецким анатомом Велькером (Hermann Welcker, 1822-1897), микротом до конца прошлого столетия претерпел многочисленные реконструкции. Первые, так называемые цилиндрические, микротомы представляли собою объектодержатель, передвигавшийся при помощи микрометрического винта; срезы делались ручной бритвой, которую при изготовлении срезов проводили по платформе, расположенной в верхней части микротома. Вплоть до последней четверти XIX в. микротом не пользовался распространением, так как не было удовлетворительной методики заливки объектов с достаточным пропитыванием кусочков органов и тканей. Лишь в семидесятых годах, благодаря работам Гиса (Wilhelm His, 1831 - 1904), микротом начинает находить широкое применение и к концу прошлого столетия окончательно вытесняет изготовление срезов от руки. Применение микротома дало возможность изготовлять тонкие срезы и получать непрерывные серии срезов, что знаменовало собою большой успех в микроскопической технике.

Если, изучая ткани прижизненно, можно было заметить некоторые структуры, пользуясь неодинаковым преломлением света отдельными частями препарата (возникающим особенно при частичном отмирании тканей), то и эти ограниченные возможности были сведены на нет применением методов уплотнения и фиксации. Необходимо было найти способы выявления различных частей клетки после фиксации тканей и это было достигнуто применением окраски срезов. В 1858 году Корти (A. Corti, 1822-1876), исследуя (1854) орган слуха, важнейшая часть которого была названа его именем, употребил для окраски микроскопических препаратов кармин. Для ботанических объектов кармин был употреблен еще ранее Гёппертом и Коном (Goeppert und Cohn) в 1849 г. и Гартингом (Pieter Н. Harting, 1812-1885) в 1854 г. Но действительное распространение кармин получил лишь с 1858 г., когда Герлах (Josef Gerlach, 1820-1895) предложил рецепт аммиачного кармина. Ранвье, Гренахер (Н. Grenadier, 1879) и Пауль Мейер (Paul Meyer, 1881) разработали способы применения кармина в качестве красителя, специфически окрашивающего ядра, и в 80-х годах кармин был излюбленным красителем, которым пользовались в повседневной микроскопической технике.

В 1865 г. Бёмер (F. Bohmer) вводит в гистологическую технику новый краситель - гематоксилин, но вплоть до 90-х годов он не выдерживает конкуренции с кармином. Наоборот, с девяностых годов гематоксилиновая техника делает значительные успехи, постепенно гематоксилин вытесняет кармин и становится обычнейшей «ядерной» краской. Особое значение приобрел метод окраски гематоксилином с протравой железными квасцами, разработанный выдающимся гистологом конца XIX в. Мартином Гейденгайном в 1892 г. Этот метод и в настоящее время принадлежит к числу лучших способов окраски тончайших структур клеток.

Наконец, в 60-х годах начали употреблять для окраски микроскопических препаратов анилиновые красители, которые с 70-80-х годов находят широкое применение. Например, индигокармин введен в гистологическую технику Меркелем (Merkel) в 1874 г., эозин - Фишером (Ernst Fischer) в 1875 г., кислый фуксин - Эрлихом (Paul Ehrlich) в 1880 г., сафранин - Германом (Е. Hermann) в 1881 г.

Микроскопия обогащается новым арсеналом средств для выявления различных тканевых и клеточных структур, которые при применении надлежащих методов фиксации и окраски предстают перед наблюдателем с такой ясностью, о которой микроскописты первой половины XIX в. не могли даже и мечтать.

Упомянем о времени введения в микроскопическую технику некоторых других употребительных методов. Окраска гематоксилином и пикрофуксином введена Ван-Гизоном (Ira Thompson van Gieson, 1866-1913) в 1889 г.; широко известный метод окраски соединительной ткани по Маллори (Frank В. Mallory, 1862-1941) в оригинальной модификации предложен в 1900 г:, а его видоизменение - азановый метод М. Гейденгайн ввел в 1915 г. Столь употребительная теперь нуклеиновая реакция по Фёльгену (Robert Feulgen, 1884-1955) предложена в 1923 г. Применение методов серебрения начало широко внедряться после работ Гольджи, первая из которых опубликована в 1873 г. Метод серебрения Бильшовского (М. Bielschowsky, 1869-11940) предложен в 1903-1904 гг. Метиленовый синий для исследования нервной системы вошел в употребление после работ А. С. Догеля (1852-1922) и А. Е. Смирнова (1859-1910), произведенных в казанской лаборатории К. А. Арнштейна (1840-1919) и опубликованных в 1887 г.

На фиксированных, нарезанных на микротоме и окрашенных тончайших срезах перед взором микроскопистов конца XIX в. открылся целый таинственный мир расцвеченных в различные цвета структур. И гистологи конца прошлого века с увлечением принялись описывать эти невиданные структуры, открывать все новые и новые детали тонкого строения клетки. Порой это были действительно важные структурные части, порой с таким же увлечением описывались артефакты, искусственные образования, вызванные действием фиксаторов или дальнейшей обработкой препарата.

Вся последняя четверть истекшего столетия прошла под лозунгом проникновения в детали тонкого строения клетки. Накапливается громадный материал, учение о строении клетки обособляется в самостоятельную ветвь биологии - цитологию. В то время как в начале XIX в. учение о клетке разрабатывалось отдельными учеными, теперь цитология разрабатывается многочисленными исследователями. Крупные открытия являются обычно результатом целого ряда работ, и выяснить долю участия отдельных ученых в разработке той или другой проблемы является делом подчас трудным, подчас и невозможным. Мы дадим в последующем изложении исторический очерк успехов цитологии, сосредоточив внимание только на некоторых проблемах.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter .

Задание 1:

внимательно прочитайте содержание работы № 2;

законспектируйте технику микроскопирования и правила работы с микроскопом в рабочую тетрадь.

Установить микроскоп у края стола против левого плеча. С правой стороны расположить открытый альбом для практических занятий. Протереть окуляр марлевой салфеткой. Обратить зеркало микроскопа вогнутой стороной к источнику света.

Привести микроскоп в рабочее состояние:

установить объектив малого увеличения на расстоянии 1-1,5 см от предметного столика;

поднять конденсор до предела;

смотря в окуляр одним глазом, не закрывая другого, равномерно и интенсивно осветить зеркалом поле зрения;

Поместить препарат на предметный столик микроскопа покровным стеклом кверху (обратить на это внимание). Передвигать препарат большим и указательным пальцами за ребро с тем, чтобы найти место, подлежащее изучению; средний палец должен упираться в предметный столик.

Опустить конденсор до положения, обеспечивающего наилучшее освещение препарата на малом увеличении.

Рассмотреть препарат с помощью 8- или 10-кратного объектива (малого увеличения). Найти место, подходящее для изучения при большом увеличении, поставить его в центр поля зрения и отрегулировать резкость изображения микровинтом.

При переходе с малого увеличения на большое необходимо, не меняя фокусного расстояния, повернуть револьверную пластинку объективов до щелчка, чтобы в рабочее положение встал 40-кратный объектив (большого увеличения). Микровинтом добиться резкого изображения. Работа макровинтом на большом увеличении запрещается, так как легко можно раздавить препарат.

Левая рука должна находиться на микрометрическом винте, слегка поворачивая его в обе стороны для просматривания деталей среза, лежащих на разной глубине поверхности среза.

Уяснив пространственное положение, пропорции и взаимоотношения деталей изучаемого объекта, приступить к зарисовке.

Запрещается снимать препарат из под объектива большого увеличения. Для того, чтобы убрать препарат с предметного столика микроскопа в рабочее положение ставится объектив малого увеличения и препарат снимается с предметного столика микроскопа.

Запрещается развинчивать какие-либо части микроскопа. В случае неисправности микроскопа обращаться к преподавателю .

Задание 2:

подготовьте микроскоп к работе, по вышеизложенным правилам работы с микроскопом под пунктами 1-2;

получите микропрепарат (любой) у преподавателя;

получите резкое изображение сначала на малом, а затем на большом увеличении микроскопа согласно пунктам 3-7 правил работы с микроскопом;

рассмотрев микропрепарат, правильно снимите его с микроскопа, согласно пункту 9 правил работы с микроскопом.

РАБОТА № 3. ТЕХНИКА ПРИГОТОВЛЕНИЯ ВРЕМЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ

Задание 1:

внимательно прочитайте содержание работы № 3;

приготовьте временный препарат.

Возьмите предметное стекло из чашки Петри, держа его за боковые грани, и положите на стол. Отделите от кусочка луковицы мясистую чешуйку. На внутренней ее стороне находится тонкая пленка. Снимите ее пинцетом и отрежьте кусочек пленки размером несколько квадратных миллиметров. Положите этот кусочек на предметное стекло, наберите пипеткой раствор йода, капните каплю йода на пленку и накройте покровным стеклом (обязательно держа его за боковые грани, чтобы не оставить следов от пальцев).

Задание 2:

ознакомьтесь с нижеизложенным описанием микроскопической картины временного препарата;

получите изображение временного препарата на малом увеличении и рассмотрите его;

получите изображение временного препарата на большом увеличении и рассмотрите его.

Рассмотрите препарат на малом увеличении. На препарате видна группа клеток, имеющих вытянутую, почти прямоугольную форму. Крупные округло-овальные ядра в клетках окрашены йодом в желто-коричневый цвет. Переведите объектив на большое увеличение и найдите двухконтурную оболочку клетки. Обратите внимание на её толщину. При внимательном рассмотрении цитоплазмы клетки видна ее зернистая структура. Ядро обычно занимает срединное положение в клетке. Иногда оно смещено к оболочке и приобретает сплющенную форму. В ядре можно заметить 1-2 ядрышка. Неокрашенные пустоты в цитоплазме клеток представляют собой вакуоли.

Задание 3:

в рабочей тетради выполните зарисовку микроскопической картины временного препарата клеток кожицы лука, предварительно ознакомившись с образцом зарисовки и содержанием работы № 4.

Зарисуйте несколько клеток. На рисунке должны быть обозначены: 1) ядро 2) цитоплазма; 3) двухконтурная оболочка.

ОБРАЗЕЦ ОФОРМЛЕНИЯ ЗАРИСОВКИ:

Препарат: Кожица лука.

Окраска: спиртовый раствор йода.

РАБОТА № 4 . ПРАВИЛА ОФОРМЛЕНИЯ ПРОТОКОЛА ПРАКТИЧЕСКОГО ЗАНЯТИЯ.

Задание 1:

внимательно прочитайте правила оформления протокола практического занятия;

законспектируйте правила оформления протокола практического занятия в рабочей тетради.

На практических занятиях необходимо иметь при себе тетрадь, ручку, карандаш простой, карандаши цветные, линейку, ластик.

В тетрадях для практических занятий студент записывает дату проведения занятия. Затем, следуя методическим указаниям, записывает номер и тему занятия, далее – номер работы, название работы и последовательно выполняет все задания к каждой работе.

При выполнении зарисовок следует выполнять следующие правила :

На практическом занятии при исследовании препарата студент в поле зрения наблюдает определенную микроскопическую картину. Результаты микроскопического исследования препарата обязательно документируются. Это может быть выполнено путем микрофотографирования или зарисовки микроскопического изображения (поля зрения, либо его части). Зарисовка является обязательным профессиональным практическим навыком студента. Правильный рисунок микроскопического изображения, выполненный в результате работы с препаратом, является единственным свидетельством освоения материала на практическом занятии.

До начала зарисовки вверху страницы пишется название номер и название работы, ниже - название препарата. При изучении простейших, гельминтов, насекомых указывается систематическое положение объекта в соответствии с международной номенклатурой, при этом обозначение типа, подтипа, класса пишется на отдельной строке по-русски и по-латыни.

Требование к рисунку:

рисунок располагается в левой части листа;

рисунок выполняется аккуратно, крупно, простым или цветным карандашами, с хорошо различимыми деталями;

на одной странице размещается не более 2 рисунков;

рисунок должен правильно отображать форму, соотношения объема и размеров (длина, ширина и др.) отдельных частей и целого объекта;

контур поля зрения микроскопа вокруг рисунка не зарисовывается.

К каждому рисунку должны быть сделаны обозначения его отдельных частей.

Требования к обозначениям:

к отдельным частям простым карандашом ставят стрелочку и против каждой пишут определенную цифру;

справа от рисунка сбоку от рисунка столбиком по вертикали располагают арабские цифры, против цифр – названия.

Оформленная практическая работа в конце занятия представляется для проверки ведущему преподавателю. При отсутствии замечаний по форме и содержанию работы преподаватель расписывается в тетради.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

к лабораторному практикуму по дисциплине «Общая биология и микробиология» для студентов направления 240700.62 «Биотехнология»

Москва 2013

Введение

Методические указания предназначены для студентов, обучающихся по направлению 240700.62 «Биотехнология» и содержат тематику лабораторных занятий, цель которых привить студентам навыки работы в лаборатории с микроорганизмами, изучить их морфологию и физиологические свойства, освоить методы микробиологических работ. В качестве объектов исследования при выполнении работ используются чистые культуры микроорганизмов – продуценты биологически активных веществ.

Задачами методических указаний являются:

Ознакомление студентов с оборудованием микробиологической лаборатории и способами стерилизации питательных сред, посуды, инвентаря;

Освоение студентами техники выделения чистых культур;

Изучение студентами морфологических и культуральных признаков важнейших групп микроорганизмов;

Освоение студентами методов количественного учета микроорганизмов, в том числе и в пищевых продуктах.

Правила работы при выполнении микробиологического практикума. Техника безопасности в микробиологической лаборатории.

В лабораторию запрещается входить в верхней одежде и класть на столы личные вещи. В микробиологической лаборатории разрешается работать только в халатах, которые защищают одежду от контаминации микроорганизмами, а также препятствуют их распространению за пределы лаборатории. Волосы необходимо закалывать.

За каждым студентом закрепляется постоянное рабочее место, которое должно поддерживаться в постоянном порядке.

На всех пробирках, чашках Петри, колбах обязательно пишется название микроорганизма, дата его посева, фамилия студента, номер группы.

В ходе работы бактериологические петли и иглы обеззараживаются прокаливанием в пламени горелки до и после отбора микроорганизмов. Приготавливая препарат или производя пересев культур микроорганизмов, выросших на жидкой среде, пользуются не петлей, а пипеткой, в верхний конец которой должен быть вложен кусочек ваты, чтобы не допустить случайного соприкосновения микробного материала с полостью рта. Использованные шпатели, пипетки помещаются в фарфоровые стаканы с дезинфицирующими растворами, спички, фильтровальную бумагу, отработанные препараты помещают в кристаллизатор. Указанные предметы класть на стол категорически запрещается.

В случае попадания исследуемого материала или культуры микроорганизма на руки, стол, халат или обувь необходимо сообщить об этом преподавателю и под его руководством провести дезинфекцию.

После окончания занятия рабочее место дезинфицируется, использованный материал и другие предметы обезвреживаются, руки моются с мылом, помещение проветривают и, по возможности, стерилизуют с помощью УФ-ламп.

Устройство микроскопа. Препараты для микроскопирования.

Микроскоп. Основные правила микроскопирования.

Изучение морфологии и строения клеток микроорганизмов, величины которых измеряются микрометрами, нанометрами, ангстремами, возможно только с помощью микроскопов. В лабораторных условиях чаще всего используется световая микроскопия.

Микроскоп имеет механическую и оптическую части (рис.1). Механическая часть включает штатив, предметный столик, тубус с револьверной головкой, макро- и микрометрические винты. Нижняя часть штатива является опорой микроскопа, верхняя – тубусодержателем, который может перемещаться с помощью механизма, приводимого в действие вращением макрометрического и микрометрического винтов, предназначенных для грубой и тонкой фокусировки препарата соответственно. При вращении винтов по часовой стрелке тубусодержатель микроскопа опускается, против – поднимается. В верхней части тубусодержателя находится вращающийся вокруг своей оси револьвер. В отверстия нижней пластины револьвера ввинчены объективы. В верхний конец тубуса вкладываются сменные окуляры. Предметный столик круглой или прямоугольной формы служит для размещения на нем препарата, имеет в центре отверстие для прохождения лучей, освещающих препарат. Подвижный столик можно передвигать в горизонтальной плоскости двумя винтами, находящимися справа и слева. Это позволяет поместить любую точку препарата в центр поля зрения. На поверхности столика находятся два зажима для закрепления препарата. В случае неподвижного предметного столика, имеется гнездо для препаратоводителя, в которое он укрепляется (рис 1).

Рис. 1. Схема микроскопа "Биолам": 1 - окуляры; 2 – бинокулярная насадка; 3 - револьверное устройство; 4 – объектив; 5 - предметный столик; 6 – конденсор; 7 – корпус коллекторной линзы; 8 – патрон с лампой; 9 – шарнир; 10 – рукоятка перемещения кронштейна конденсора; 11 – микровинт; 12 – макровинт; 13 – тубусодержатель; 14 – винт для крепления насадки; 15 – световой индикатор; 16 – выключатель.

Оптическая часть микроскопа состоит из осветительного аппарата, объектива и окуляра. Осветительная часть микроскопа состоит из расположенных под предметным столиком конденсора и встроенного осветителя с низковольтной лампой накаливания. Конденсор представляет собой оптическую систему из двух линз: плосковыпуклой (верхней) и двояковыпуклой (нижней). Конденсор концентрирует параллельные лучи, идущие от источника света, в одной точке, фокусе, который должен находиться в плоскости препарата. Конденсор специальным винтом, расположенным под предметным столиком, перемещается вверх и вниз. Под конденсором имеется ирисовая диафрагма и откидная оправа для светофильтра. Ирисовая диафрагма служит для задержания лишних лучей света и позволяет при необходимости уменьшить апертуру конденсора (охват линзы; характеризуется количеством лучей, попадающих в линзу). Линзы конденсора вместе с ирисовой диафрагмой вмонтированы в цилиндрическую оправу.

Объектив представляет собой наиболее важную часть микроскопа. Он состоит из системы линз, заключенных в металлическую оправу, которые дают действительное увеличенное обратное изображение. Наружная линза, обращенная к предмету, называется фронтальной, это основная и единственная в объективе линза, дающая увеличение. Выше фронтальной располагаются коррекционные линзы. Они имеют различную кривизну и изготавливаются из стекла разной оптической плотности. Коррекционные линзы предназначены для устранения погрешностей и получения более четкого изображения.

Микроскопы снабжают съёмными объективами с собственным увеличение 8 х, 40 х и 90 х (100 х), обозначенными на металлической оправе. Увеличение объектива зависит от фокусного расстояния фронтальной линзы и от ее кривизны. Чем больше кривизна фронтальной линзы, тем короче фокусное расстояние и тем больше увеличение объектива. Поэтому чем больше увеличение дает объектив, тем ниже его следует опускать над плоскостью препарата.

Окуляр служит для рассмотрения изображения объекта, увеличенного с помощью объектива, и содержит две линзы: глазную (верхнюю) и собирательную (нижнюю). Микроскопы снабжают окулярами с увеличением в 5, 7, 10, 12, 15 и 20 раз, что указано на их оправе (5 х, 7 х, 10 х, 12 х, 15 х и 20 х). Различают моно- и бинокулярные микроскопы.

Общее увеличение , которое дает микроскоп, определяется произведением увеличения объектива на увеличение окуляра. Однако общее увеличение еще не характеризует всех возможностей микроскопа. Увеличенное изображение может оказаться как четким, так и нечетким. Отчетливость получаемого изображения определяется разрешающей способностью микроскопа – минимальным расстоянием между двумя точками, когда они еще не сливаются в одну. Чем больше разрешающая способность микроскопа, тем меньшей величины объект можно увидеть.

Микроскопический объект можно рассматривать в трех типах системы: сухой – между линзой объектива и объектом находится воздух; водной – между линзой объектива и объектом находится капля воды – водная иммерсия; масляной – линза объектива погружена в каплю иммерсионного масла – кедрового, касторового, вазелинового – масляная иммерсия.

Лабораторная работа №1.

Цель.

Оборудование

Ход работы.

Правила работы с микроскопом.

1.Установить микроскоп штативом к себе, предметным столиком от себя.

2.Поставить в рабочее положение объектив малого увеличения.

3.Глядя в окуляр левым глазом, вращайте зеркало в разных направлениях, пока поле зрения не будет освещено ярко и равномерно.

4.Положите на предметный столик приготовленный препарат (покровным стеклом вверх), чтобы объектив находился в центре отверстия предметного столика.

5.Под контролем зрения медленно опустить тубус с помощью макровинта, чтобы объектив находился на расстоянии 2мм от препарата.

6.Смотреть в окуляр и медленно поднимать тубус, пока не появится изображение объекта.

7.Вращая револьвер, перевести в рабочее положение объектив большого увеличения.

9.Опустить тубус под контролем глаза (смотреть не в окуляр, а сбоку) почти до прикосновения с препаратом.

10.Глядя в окуляр, медленно поднимать тубус, пока не появится изображение.

11.При зарисовке препарата смотреть в окуляр левым глазом.

Задание2. Переписать правила работы с микроскопом в тетрадь для лабораторных работ.

Методика приготовления временного препарата.

1.Взять предметное стекло, держа его за боковые грани, положить на стол.

2.Поместить в центр стекла объект – кожицу чешуи лука. Пипеткой нанести на объект одну каплю воды.

3.На предметное стекло положить покровное стекло.

4.Рассмотреть готовый препарат.

Задание3. Зарисовать увиденное в тетрадь.

Лабораторная работа №2.

Обнаружение биополимеров в биологических объектах.

Цель. Доказать присутствие в биологических объектах белков, углеводов и липидов.

Ход работы.

1.В пробирку внести 5 капель 1% - го яичного белка, три капли 10% раствора гидроксида натрия и 1 каплю 1% раствора сульфата меди и перемешивают. Содержимое пробирки приобретает сине - фиолетовое окрашивание, следовательно …

2.В пробирку внести 10 капель 1% - го раствора крахмала и одну каплю 1% раствора йода. Наблюдается сине - фиолетовое окрашивание, следовательно …

3.В сухую пробирку налить 10 капель ацетона; в стаканчик положить желток куриного яйца.Помешивая палочкой, по каплям прилить 40 мл горячего спирта.

4.Когда раствор остынет, отфильтровать его в сухую пробирку. Фильтрат должен быть прозрачным. При добавлении реактива выпадает белый осадок, следовательно …

Лабораторная работа №3.

Каталитическая активность ферментов в живых тканях.

Цель: Сформировать знания о роли ферментов в живых тканях, закрепить умение делать выводы по наблюдениям.

Оборудование: Н2О2(пероксид водорода), 6 пробирок, ткани растений (сырой и варёный картофель), ткани животных (сырое и варёное мясо), песок, ступка, пестик.

Ход работы:

1) Приготовить 5 пробирок. В 1-ую поместить песок, во 2- ую пробирку сырой картофель, в 3-ю пробирку варёный картофель, в 4- ую пробирку сырое мясо, в 5-ую пробирку варёное мясо. Капните в каждую пробирку Н2О2, пронаблюдайте, что будет происходить в каждой пробирке.

2) Размельчить в ступке сырой картофель с песком, перенесите измельченную структуру в 6-ую пробирку, и капнуть туда. Н2О2, сравните активность измельченной и целой растительной ткани.

3) Наблюдения занесите в таблицу.

Заполните третью колонку таблицы, используя ниже расположенные предложения:

1.Реакции нет

2.Выделяется кислород, белок распадается до первичной структуры и превращается в пену.

3.Выделяется кислород, белок распадается до первичной структуры и превращается в пену, мясо белеет и всплывает.
4. Реакция та же что и в сыром мясе, но происходит в два раза быстрее.

4)Вывод: (для формулировки вывода к лабораторной работе необходимо ответить на вопросы)

№1) В каких пробирках проявилась активность ферментов?
(почему?).

№2)Как проявляется активность ферментов в живых и мёртвых тканях?

№3)Как влияет измельчение ткани на активность ферментов?

№4)Различается ли активность ферментов в животной и растительной клетке?

1)Активность проявилась во 2,4,6 пробирках, потому что в этих пробирках были сырые продукты, а в сырых продуктах содержится белок, а в остальных пробирках были варёные продукты, а, как известно в неживых - варёных продуктах белок при варении разрушался, и реакции не проявил. Поэтому организмом лучше усваивается продукты, содержащие белок.

2)В мёртвых тканях активность ферментов отсутствует, т. к. белок в этих тканях был разрушен при варке, а в живых тканях при взаимодействии с перекисью водорода из ткани выделялся кислород, белок расщеплялся до первичной структуры и превращался в пену.

3)При измельчении живой ткани активность происходит в два раза быстрее, чем у не измельченной, т. к. растёт площадь соприкосновения белка и Н2О2.

4)В растительных клетках реакция происходит медленнее, чем в животных, т. к. в них меньше белка, а в животных белка больше и реакция в них протекает быстрее.

4)Выводы: Белок содержится только в живых продуктах, а в варёных продуктах белок разрушен, поэтому никакой реакции с варёными продуктами и песком не происходит. Если же ещё и размельчить продукты, то реакция будет проходить быстрее.

Лабораторная работа №4.

Ход работы.

1.Приготовить препарат для микроскопа. Для этого в слабый раствор хлорида натрия поместить кусочек кожицы чешуи лука. Можно увидеть сморщивание клеток, что указывает на проницаемость клеточной оболочки. В данном случае вода из клетки выходит в окружающую среду.

2.Перенести клетки в каплю дистиллированной воды или оттянуть из - под покровного стекла раствор при помощи фильтровальной бумаги и заменить его на дистиллированную воду. Пронаблюдать, как клетки набухают, так как в них поступает вода.

3. Заполните таблицу и сформулируйте вывод, ответив на вопрос: какое физиологическое свойство клеточной мембраны вы наблюдали в ходе выполнения лабораторной работы?

Лабораторная работа №5.

Оборудование.

1.Микроскоп.

2.Предметные стекла и покровные.

3.Пипетки, стаканы с водой, пинцеты, скальпели, настой йода, водный раствор туши.

4.Фуксин, метиленового синего, настой мяса, рыбы или овощей, пленка лука.

Таблица строения бактериальных, растительных и животных клеток.

Ход работы.

1.На предметное стекло поместить каплю настоя с бактериями, добавить каплю туши (на общем фоне клетки бактерий неокрашенные). Препарат рассмотреть.

Зарисовать клетки бактерий.

3.Приготовить временные препараты растительной и животной клеток.

От кусочка луковицы отделить мясистую чешуйку. На внутренней стороне находится тонкая пленка. Снять пленку, отрезать. Положить на предметное стекло, набрать пипеткой раствор йода, капнуть на пленку, накрыть покровным стеклом. Рассмотреть при малом увеличении. Крупные округлые ядра в клетках окрашены йодом в желтый цвет.

Лабораторная работа № 6.

Лабораторная работа № 8

Лабораторная работа № 9

Лабораторная работа №10

«Решение генетических задач на наследование, сцепленное с полом, взаимодействие генов».

ЦЕЛЬ: отработать методику решения генетических задач различной степени сложности, на конкретных примерах выяснить как наследуются признаки, сцепленные с полом.

Ход работы:

№1. Одна из форм шизофрении наследуется как рецессивный признак, сцепленный с Х хромосомой. Определить вероятность рождения ребёнка с шизофренией от здоровых родителей, если известно, что бабушка со стороны отца и дед со стороны матери страдали этими заболеваниями.

Фенилкетонурия (нарушение аминокислотного обмена) наследуется как рецессивный признак. Жена гетерозиготна по гену фенилкетонурии, а муж гомозиготен по нормальному аллелю этого гена. Какова вероятность рождения у них больного ребёнка?

У человека ген, вызывающий одну из форм наследственной глухонемоты, рецессивен по отношению к гену нормального слуха и сцеплен с Х хромосомой. От брака глухонемой женщины с нормальным мужчиной родился глухонемой ребёнок. Определить генотипы всех членов семьи

Задача № 9 . У собак черный цвет шерсти доминирует над кофейным, а короткая шерсть - над длинной. Обе пары генов находятся в разных хромосомах.

1. Какой процент черных короткошерстных щенков можно ожидать от скрещивания двух особей, гетерозиготных по обоим признакам?

2. Охотник купил черную собаку с короткой шерстью и хочет быть уверен, что она не несет генов длинной шерсти кофейного цвета. Какого партнера по фенотипу и генотипу надо подобрать для скрещивания, чтобы проверить генотип купленной собаки?

Задача № 10. У человека ген карих глаз доминирует над геном, определяющим развитие голубой окраски глаз, а ген, обусловливающий умение лучше владеть правой рукой, преобладает над геном, определяющим развитие леворукости. Обе пары генов расположены в разных хромосомах. Какими могут быть дети, если родители их гетерозиготны?

Л/р. № 4 "Изучение изменчивости растений и животных, построение вариационного ряда и кривой"

Цель:

• углубить знания о норме реакции как пределе приспособительных реакций организмов;
• сформировать знания о статистическом ряде изменчивости признака; выработать умение экспериментально получать вариационный ряд и строить кривую нормы реакции.

Оборудование:

• наборы биологических объектов: семена фасоли, бобов, колосья пшеницы, листья яблони, акации и пр.
• не менее 30 (100) экземпляров одного вида;
• метр для измерения роста учащихся класса.

Ход работы:

1. расположите листья (или другие объекты) в порядке нарастания их длины;
2. измерьте длину объектов, рост одноклассников, полученные данные запишите в тетради. Подсчитайте число объектов, имеющих одинаковую длину (рост), внесите данные в таблицу:

1. постройте вариационную кривую, которая представляет собой графическое выражение изменчивости признака; частота встречаемости признака – по вертикали; степень выраженности признака – по горизонтали

! ! Обратите внимание на критерии оценки лабораторной работы – наблюдения; составления таблицы и графика!

1. Дайте определение терминам – изменчивость, модификационная изменчивость, фенотип, генотип, норма реакции, вариационный ряд.
2. Какие признаки фенотипа имею узкую, а какие – широкую норму реакции? Чем обусловлена широта нормы реакции, и от каких факторов она может зависеть?

Л/р. № 6 “Морфологический критерий в определении вида”

Цель:

• используя морфологический критерий, определить названия видов растений, относящихся к одному семейству.

Оборудование:

• гербарные или живые образцы растений одного вида.

Ход работы

1. Рассмотрите предложенные образцы. Определите при помощи учебника ботаники, к какому семейству они относятся. Какие черты строения позволяют отнести их к одному семейству?
2. Пользуясь карточкой-определителем, определите названия видов растений, предложенных для работы.
3. Заполните таблицу:

Название семейства и общие признаки семейства	№ растения	Признаки вида	Название вида
	Первое растение
Второе растение

Сделайте вывод о достоинстве и недостатках морфологического критерия в определении вида.

! ! Обратите внимание на критерии оценки лабораторной работы – наблюдения; и составления сравнительной таблицы!

1. Дайте определение терминам – эволюция, вид.
2. Перечислите основные критерии вида и дайте им краткую характеристику.

“Морфологические особенности растений”

1. Вывод: каким образом морфологический критерий помог вам в определении вида растений? Назвать виды растений, с которыми вы работали.

Лабораторная работа № 2.

Лабораторная работа №6.

Изучение и описание экосистемы своей местности.

Выявление типов взаимодействия разных видов

в данной экосистеме (на примере дубравы).

Цель работы: 1) изучить структуру биоценоза дубравы, рассмотреть

показатели, характеризующие биоценоз;

2)выявить многообразие межвидовых взаимоотношений,

определить их значение в природе и жизни человека.

Оборудование: таблица «Биоценоз дубравы», гербарные растения и

коллекции животных данного биоценоза, инструктивные карточки.

Ход работы.

1. 1)Выделите ярусы леса и опишите каждого яруса видовой состав

растений.

2)Отметьте, от каких факторов зависит ярусность леса.

П. 1)Отметьте видовой состав животных в каждом ярусе.

2)Приведите примеры влияния растений на животных

3)Запишите примеры пищевых цепей в ярусах.

1П. 1)Охарактеризуйте нижний ярус леса (подстилку, почву, их обитателей,

отметьте цепи питания).

1У. Объясните значение леса в природе и жизни человека.

У. Вывод. Что такое дубрава?

Лабораторная работа №12.

Ход работы.

Полное доминирование.

Дурман, имеющий пурпурные цветы, дал при самоопылении 30 потомков с пурпурными цветами и 9 с белыми. Какие можно сделать выводы относительно наследования окраски цветов у этого вида? Какая часть потомков, имеющих пурпурные цветы, должна давать «чистое» по этому признаку потомства?

На неполное доминирование.

У львиного зева красная окраска цветков А не полностью доминирует над белой окраской а . Взаимодействие генов А и а дает розовую окраску цветков. При скрещивании двух растений львиного зева получены гибриды, из которых ¼ имела красные цветки, ½ розовые и ¼ белые. Определите генотип и фенотип родителей.

3. Кодоминирование – наследование групп крови человека в системе АВО .

У матери третья группа крови у отца – неизвестна. Ребенок имеет первую группу. Может ли у отца быть вторая группа крови?

Полигибридное скрещивание.

· Какая часть потомства от самоопыления гибрида АаВвСс будет доминантна по всем генам?

· У душистого горошка высокий рост растения, зеленый цвет и гладкая форма семян – доминантные признаки. Скрещены растения: высокое с зелеными с зелеными морщинистыми семенами и карликовое с зелеными гладкими семенами. Из гибридных семян выросло ¾ растений высоких с зелеными гладкими семенами и ¼ высоких с желтыми гладкими семенами. Каковы генотипы скрещенных растений?

П. Анализ родословных.

В семье родился голубоглазый темноволосый ребенок, похожий по этим признакам на отца. Мать у ребенка кареглазая темноволосая, бабушка по материнской линии – голубоглазая темноволосая, дедушка по материнской линии – кареглазый светловолосый, бабушка и дедушка по отцовской линии – кареглазые темноволосые.

Составьте схему родословных трех поколений и определите:

а) каковы генотипы всех упомянутых лиц;

б) какова вероятность рождения в этой семье голубоглазого светловолосого ребенка; какова вероятность рождения кареглазого светловолосого ребенка?

Лицо, от которого начинают составлять родословную, называют пробандом. Братьев и сестер пробанда называют сибсами .

Задача 2.

По представленной родословной (рис.2) определите характер наследования тяжелого заболевания. Установите возможные генотипы: а) исходных родителей; б) потомков первого поколения 1, 2, 3; в) потомков второго поколения 4, 5; г) потомков третьего поколения 6, 7, 8.

В стандартной родословной используются простые условные обозначения и правила . Достаточно знать только некоторые из них:

1. Мужчины всегда изображаются в виде квадратов , женщины - в виде окружностей .
2. Графически изображаемые связи между членами родословной бывают только трех видов: "мужья-жены", "дети-родители" и "братья-сестры".
3. Супруги, братья и сестры (в т.ч. двоюродные и троюродные) всегда изображаются на одном горизонтальном уровне с тобой (т.е. в одном поколении). Разница в возрасте не играет никакой роли.
4. Дети изображаются на горизонтальном уровне ниже твоего, а твои родители - на горизонтальном уровне выше твоего. То же самое относится к детям и родителям всех твоих братьев и сестер.
5. Все поколения нумеруются сверху вниз римскими цифрами, а все индивидуумы в каждом поколении - слева направо арабскими цифрами. Это позволяет обозначить каждого человека личным идентификационным номером (например - III:15, что означает 15-й индивидуум в третьем поколении). Быстро и удобно.

Практически это изображается следующим образом.
Предположим, Вы - женщина (II:3) и у Вас имеется сын (III:2)и дочь (III:3), кроме того - родная сестра (II:2), также имеющая дочь ((III:1). У Вашего мужа (II:4) есть брат (II:5), который имеет двух мальчиков близнецов (III:4 и III:5 - монозиготные близнецы). Пометим Ваш символ стрелкой - т.е. возьмем Вас в качестве пробанда . Тогда родословная будет выглядеть так:

Лабораторная работа №1.

Устройство световых микроскопов и техника микроскопирования.

Цель. На основе знаний устройства светового микроскопа освоить технику микроскопирования и приготовления временных микропрепаратов. Ознакомиться с правилами оформления лабораторной работы.

Оборудование . Микроскоп на каждого ученика. Предметные и покровные стекла, пипетки, стаканчики с водой, вата, пинцеты, ножницы, тетрадь, альбом. Схема устройства микроскопа и его частей.

Ход работы.

Рассмотрите основные части микроскопа: механическую, оптическую и осветительную.

К механической части относятся штатив, предметный столик, тубус, револьвер, макро- и микрометрические винты.

Оптическая часть микроскопа представлена окулярами и объективами. Окуляр (лат.okulus -глаз) находится в верхней части тубуса и обращен к глазу.

Это система линз, заключенных в гильзу. По цифре на верхней поверхности окуляра можно судить о кратности его увеличения (х 7, х 10, х 15). Окуляр можно вынуть из тубуса и заменять по мере необходимости. На противоположной стороне тубуса вращающая пластина, или револьвер (лат. rewolvo) - вращаю), в которой три гнезда для объективов. Объектив - система линз, они имеют различную кратность. Общее увеличение микроскопа равно увеличению окуляра, умноженному на увеличение объектива.

Осветительная часть состоит из зеркала.

Задание1. Зарисовать микроскоп и пометить его части.